Anticuerpos monoclonales de primera generación

Los anticuerpos policlonales, o antisueros, son poblaciones complejas de Ac, formadas por distintas clases de Ig en las que está presente una variedad de especificidades. Por el contrario, el término anticuerpo monoclonal (AcMo) se usa para referirse a una población de moléculas de Ac, todas idénticas, las cuales consecuentemente, poseen todas la misma especificidad. De lo anterior se desprende que, en una prueba analítica, el chance de obtener falsos positivos, es decir, "reconocer lo que no es como si lo fuera" es mucho menor cuando se usan reactivos monoclonales.

En 1975, en un trabajo que posteriormente les valió el premio Nobel, G. Kohler y C. Milstein demostraron la posibilidad de producir AcMo mediante la fusión de linfocitos B con células mielomatosas (células tumorales inmortales). Ellos demostraron que los híbridos resultantes de tal fusión heredan la capacidad para crecer indefinidamente en cultivo y para producir anticuerpos, y que, además, es posible aislar del producto heterogéneo de fusión aquellos híbridos secretores del anticuerpo en el cual se está interesado (56). Así nacieron los AcMo, posteriormente denominados de primera generación, para distinguirlos de los anticuerpos producidos mediante técnicas de biología molecular y ADN recombinante, que han sido llamados de segunda generación.

La técnica original descrita por Kohler y Milstein (Figura 4) permite la obtención de AcMo de ratón. De manera resumida, el proceso se inicia con la inmunización de ratones de laboratorio (cepa Balb/c) con el antígeno para el cual se desea producir los anticuerpos. Una vez que se tiene la certeza del status inmune de estos animales (por lo general esto se establece tomando muestras de sangre y examinando y/o cuantificando la presencia de anticuerpos específicos en el suero inmune), los mismos son sacrificados y se obtiene el bazo, en el cual se encuentra una población numerosa de linfocitos B. A continuación, los esplenocitos se fusionan con células mielomatosas inmortales que son mantenidas en el laboratorio en la forma de líneas celulares gracias a su capacidad para crecer indefinidamente en cultivo. La fusión, fenómeno poco común en células somáticas, es facilitada mediante la adición de agentes virales (virus Sendai), químicos (polietilenglicol) o físicos (electricidad), de los cuales el más usado es la sustancia química denominada polietilenglicol (PEG). El producto de la fusión entre un esplenocito y una célula mielomatosa es denominado hibridoma. Los hibridomas heredan características fenotípicas de ambas células parentales de manera tal que son capaces de crecer indefinidamente y de producir el anticuerpo codificado en los genes del esplenocito pariente. Obviamente, la población de hibridomas obtenida mediante una fusión, como la descrita anteriormente, es heterogénea en cuanto a los anticuerpos secretados por ella. Con el objeto de seleccionar los híbridos productores del anticuerpo de interés se realiza clonación celular. Esta clonación consiste en sembrar los hibridomas en microcultivos a una densidad celular tan baja que se garantiza que las células integrantes de la población obtenida en cada microcultivo sean todas idénticas, es decir, conformen un clon. Los anticuerpos secretados por estas poblaciones clonales de hibridomas son anticuerpos monoclonales. Utilizando un principio, similar al antes descrito, se han preparado reactivos monoclonales provenientes de otras especies, inclusive humanos. Numerosas revisiones han sido publicadas en las cuales se examina la producción y uso de estos reactivos (22; 31; 50; 71; 107).

Ahora bien, además de su altísima especificidad, es necesario reconocer otros dos atributos que han contribuido al éxito de los AcMo como reactivos analíticos. En primer lugar, los AcMo son sustancias químicamente bien definidas, su naturaleza y estructura se conoce en detalle y ello permite la formulación de preparaciones estables y facilita enormemente los procedimientos para su conjugación a trazadores tales como sustancias fluorescentes, enzimas, radioisótopos, oro coloidal, moléculas electrón-densas (ferritina), etc. En segundo lugar, son reactivos susceptibles de ser preparados en forma pura, en condiciones muy controladas y en grandes cantidades.

En lo concerniente a aplicaciones biomédicas, los AcMo de primera generación han desplazado de muchas aplicaciones a los anticuerpos policlonales, han permitido el desarrollo y avance de numerosas y nuevas pruebas diagnósticas y son, en la actualidad, los reactivos de elección para aplicaciones analíticas, tanto en el ámbito de lo médico-clínico como en distintas áreas de la investigación en biociencias. Lo anterior es cierto para todo aquello relacionado con pruebas de laboratorio "in vitro", tanto en clínica como en investigación.

Por razones de espacio, mencionaremos solo algunos ejemplos de AcMo de primera generación, los cuales han encontrado aplicaciones de interés en biomedicina, no sin antes advertir que se trata de una muestra pequeña tomada de un universo mucho más amplio y, por tanto, imposible de cubrir en su totalidad en el presente contexto. Comenzaré por mencionar las numerosas pruebas diagnósticas para fenotipificación de tumores sanguíneos que actualmente hacen uso de AcMo de primera generación. Aun cuando algunas de estas enfermedades pueden diagnosticarse claramente, mediante criterios clínicos e histológicos bien establecidos, hay otros casos, como las leucemias linfoblásticas agudas y los linfomas del tipo no-Hodgkin, donde es imprescindible la inmunofenotipificación para el establecimiento inequívoco del diagnóstico, la clasificación, la prognosis y el tratamiento (13; 114). La forma rutinaria, tomadas por estas pruebas de tipificación, es la citometría de flujo con paneles de AcMo fluorescentes. Estos Ac fluorescentes reconocen moléculas marcadoras de las poblaciones sanguíneas en estudio y las tiñen, permitiendo su identificación diferencial por medios electrónicos.

Otro ejemplo ilustrativo, lo constituyen los AcMo con especificidad por la molécula CD4, la cual se expresa en la superficie de un subset de linfocitos T humanos. Uno de los mejores indicadores de la progresión de la infección por el virus HIV, hacia la aparición del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en los pacientes infectados, es precisamente una caída sustancial en el número de linfocitos T circulantes en la sangre que portan este marcador de superficie CD4. La prueba de rutina empleada para la estimación del número de linfocitos T CD4+ utiliza AcMo fluorescentes anti-CD4 humano para teñir y luego examinar, por citometría de flujo o en el microscopio de fluorescencia, las muestras de sangre de los individuos seropositivos.

La tipificación de grupos sanguíneos humanos, como el ABO, de crucial importancia en transfusiones y transplantes, se realiza en la actualidad mediante pruebas de aglutinación en las que se utilizan AcMo.

Pero los AcMo no han servido, únicamente, para el estudio de moléculas asociadas a la superficie de células. Existe además un sinnúmero de moléculas solubles cuya detección en fluidos biológicos (sangre, orina, etc.) es de interés médico-clínico. Algunos ejemplos son : drogas o metabolitos de drogas como la marihuana (2W), la cocaína (3W), la ciclosporina (4W), hormonas como la hCG (test de embarazo; 3W), proteínas asociadas a ciertos tipos de cáncer como el PSA (cáncer de prostata; 5W) y el CEA (adenocarcinoma de colon; 6W) o proteínas indicadoras de infecciones por virus como Hepatitis B (7W) y CMV (4W). En la actualidad, los tests para la detección, y/o cuantificación de estas moléculas, utilizan AcMo y, en su mayoría, toman la forma de inmunoensayos en los que una enzima (ELISA), un radioisótopo (RIA) o un colorante ("dipstick") sirven como medio de detección.

Virtualmente, todos los ejemplos de AcMo referidos se han obtenido mediante la generación de hibridomas de origen múrido (ratón o rata). Por desgracia, el uso de este tipo de AcMo, con intenciones profilácticas o terapéuticas, en humanos ha encontrado obstáculos importantes. El primero de ellos es que se trata de proteínas extrañas para el ser humano. Consecuentemente, su administración conduce a la aparición de una respuesta inmune humana anti-AcMo, con la cual se obstaculiza la eficacia del tratamiento. Además, la mediación de funciones efectoras necesarias o deseables en ciertas situaciones, y el catabolismo de estos anticuerpos de ratón o rata en el cuerpo humano, es diferente al de los correspondientes anticuerpos humanos. Por último, hay moléculas humanas, como los aloantígenos del complejo principal de histocompatibilidad y los antígenos del sistema sanguíneo Rh, que no son distinguidos apropiadamente por el sistema inmune de los roedores y, en consecuencia, no es posible producir AcMo de utilidad práctica, con especificidad, por estos antígenos. De esta manera, una de las razones más importantes que ha impulsado el desarrollo de los AcMo de segunda generación es precisamente esta imposibilidad de utilizar Ac de roedores en humanos con fines profilácticos o terapéuticos.