PacB: Estudios Moleculares
En nuestro laboratorio dirigimos esfuerzos
con la finalidad de dilucidar el modo de acción del carácter
PacB. Para ello se procedió a clonar una región del DNA del
plásmido Mip233 (IncHI3), que codifica para ambos fenotipos
(PacB y Ter) (15). Se obtuvo el mapa de restricciòn
del clon recombinante y se subclonó el menor fragmento capaz de
conferir a la célula hospedera ambos fenotipos. El clon
resultante, denominado pB22, contiene un inserto de 2.200 pb.
Representa el menor segmento de DNA reportado hasta la fecha que
es capaz de expresar resistencia a colicinas formadoras de
canales y a oxianiones de telurito, con la misma capacidad del
plásmido parental Mip233. Nuestros resultados indican que PacB y
Ter están ligados no solo de forma genética sino
también físicamente, y que ambos fenotipos son inducibles por
exposición previa a niveles subtóxicos de telurito ó de
colicinas. Por el análisis de la secuencia nucleotídica de los
clones de pMER610 y R478, se han reportado hasta 7 marcos de
lecturas (ORFs) como necesarios para la expresión de la
resistencia a Telurito. Los resultados de nuestro laboratorio
indican que no es necesaria la expresión de un gran número de
proteínas.
Para producir su acción letal, tanto las colicinas como el telurito deben ser translocados de la membrana externa a la interna. Debido a esto, en el Laboratorio utilizamos cepas mutantes de E. coli con alteraciones bien en el Sistema Ton ó bien en el Sistema Tol. Nuestros resultados indican que para que ocurra una efectiva protección se necesita el producto intacto del gen tolC, ya que mutantes TolC- portadoras del clon pB22 son incapaces de adquirir el fenotipo PacB-Ter (14).
El análisis de la secuencia parcial de nucleótidos del clon pB22 ha revelado un marco de lectura abierto que presenta un alto grado de homología con la proteína O-acetil sulfidrilasa (CysK) de varios organismos. Esta enzima es la responsable de la síntesis de cisteína a partir de O-acetilserina y sulfuro de hidrógeno. Dada la similitud química y física entre el telurito y el azufre sugerimos que el producto proteico de pB22 sea el encargado de reducir la sal de telurito a telurio metálico, produciéndose de esta manera el fenotipo de Ter.
Para complementar los estudios molecular realizamos análisis de Northern Blot, determinando que el clon pB22 produce un transcrito con un tamaño estimado de 1.200 bases.
