El posible papel del NO en funciones inflamatorias podría ejercerse a varios niveles:

1. inicialmente, por su capacidad de producir vasodilatación, alteración de la permeabilidad vascular y extravasación de proteínas plasmáticas (Whittle, 1995; Szabó y Dawson, 1998).
2. en una fase mas tardía o crónica de la inflamación, la señal inflamatoria puede magnificarse mediante la producción de moléculas como el factor transcripcional NF-kB, el factor de necrosis tumoral ? (FNT-?) y el interferón ? (?-IFN); estos, promoverían la trascripción de la iNOS, generándose grandes cantidades de NO, mayor vasodilatación y edema; este NO puede sufrir procesos de transformación a productos altamente reactivos capaces de inducir daño por diversos mecanismos, siendo uno de los más importantes, el daño de la doble hélice del DNA, con la consecuente la muerte celular (Ridger y col., 1997; Szabó y Dawson, 1998).

Inflamación experimental
Los modelos experimentales de inflamación son herramientas valiosas e indispensables para entender, entre otras cosas, la complejidad de la participación de diferentes mediadores en la respuesta inflamatoria in vivo. Como ya se ha descrito, el NO puede actuar como mediador del componente vasodilatador de la inflamación, así como tener un papel relevante en la extravasación de macromoléculas iniciada por diversos estímulos inflamatorios (Noel y col., 1995)

La importancia del NO en la modulación de este proceso puede variar según las condiciones experimentales, por lo cual algunos resultados publicados hasta el presente han arrojado resultados contradictorios (Giraldelo y col., 1994; Paul-Clark y col., 2001). Por ejemplo, estudios con ratones deficientes de iNOS permitió concluir que la iNOS ejerce un efecto modesto sobre la expresión vascular de la molécula de adhesión celular vascular-1 (Vcam-1) en la inflamación digestiva aguda, mientras que no se observó ningún efecto en un modelo inmune de colitis crónica (Kawachi y col., 1999). El papel del NO también ha sido evaluado en modelos clásicos de inflamación, como el del edema de la pata por inyección de carragenina, donde se obtuvieron niveles elevados de nitritos y de iNOS, 6 horas después de la administración de la carragenina. Los autores concluyeron que el NO formado por acción de la cNOS desempeñaría un papel importante para iniciar esta respuesta, mientras que la iNOS mantendría la inflamación más tardía y sostenida. La administración sistémica del L-NAME o del L-NMMA (inhibidores no selectivos de la NOS) reduce las fases tempranas y tardías del edema (Salvemini y col., 1996). En contraste, la administración de inhibidores más selectivos de los iNOS, como la L-NIL y la aminoguanidina, inhibe solamente la fase tardía del edema, así como la migración de neutrófilos y la elevación de los niveles de nitritos y de PGE2 en la pata inflamada (Salvemini y col., 1996). Otros estudios también han concluido que la inhibición farmacológica de iNOS no produce la eficacia antiinflamatoria prevista, probablemente debido al gran número de otros factores involucrados en la respuesta inflamatoria (Giraldelo y col., 1994; Paul-Clark y col., 2001).

Hoy en día se sabe que los fármacos esteroideos con actividad antiinflamatoria inhiben la síntesis de la iNOS (Di Rosa y col., 1990; McCartney-Francis y col., 2001). Otras drogas antiinflamatorias también inhibirían la inducción de los iNOS, incluyendo las drogas antiinflamatorias no esteroideas (AINEs) (Cirino y col., 1996) o los productos nuevos que demuestran efectos antiinflamatorios en modelos experimentales, tales como los derivados de chalcona, capaces de inhibir la síntesis de novo de la iNOS (Herencia y col., 1999) o un derivado nuevo del ditriazine, también capaz de inhibir la inducción de la COX (Rioja y col., 2000; 2002).

Estos resultados no concluyentes y a veces contradictorios destacan la necesidad de mayor investigación en esta área; de allí la importancia de disponer de modelos animales válidos que permitan estudiar los mecanismos desencadenantes, los neurotransmisores y los mediadores involucrados en el proceso inflamatorio, así como la secuencia de eventos que lo acompañan.

Modelos experimentales para el estudio de la inflamación: Inflamación neurogénica inducida por agentes antineoplásicos
Desde principios del siglo XX y como consecuencia de los estudios sobre "vasodilatación antidrómica", se sugirió que los cambios vasculares locales podrían producirse como resultado de una activación retrógrada de los nervios sensoriales de la piel (Bruce, 1910; Jancso y col., 1967). Se demostró que esta respuesta no es abolida por antagonistas a la acetilcolina, la histamina, la serotonina, la adrenalina o la noradrenalina, pero si desaparecía con la denervación o con el pretratamiento con capsaicina (Holtzer, 1988; 1991).

Esta vasodilatación y la extravasación de proteínas plasmáticas desarrollada por la activación neuronal retrógrada, como los antes mencionados se denomina inflamación neurogénica (Barnes y col., 1990), y es causada por agentes de diferente naturaleza, capaces de estimular a las fibras aferentes primarias sensibles a capsaicina (FAPSC) y provocar la liberación antidrómica de diversos neurotransmisores, principalmente sP, la neurokinina A y el péptido relacionado al gen de la calcitonina (PRGC), todos ellos capaces de producir vasodilatación, edema, contracción de la musculatura lisa y reclutamiento de células inflamatorias (Barnes y col., 1990; Regoli y col., 1994). Este fenómeno ha sido demostrado en muchos tejidos y órganos, incluyendo la piel, el tracto respiratorio, el ojo, el tracto gastrointestinal, las articulaciones y la vejiga urinaria (Holtzer, 1988), pudiendo contribuir al componente inflamatorio en un número de enfermedades o situaciones, tales como asma, rinitis, artritis, conjuntivitis, úlceras gastrointestinales, inflamaciones de la piel (Barnes y col, 1990; Holtzer, 1988) y lesiones producidas por algunos agentes antineoplásicos (Ahluwalia y col., 1994; Alfieri y Gardner, 1997).

Entre los agentes que pueden iniciar eventos inflamatorios neurogénicos se encuentran varios agentes antineoplásicos (Ahluwalia y col., 1994; Alfieri y Gardner, 1997; Alfieri y Gardner, 1998). Los fármacos antineplásicos producen inflamación y daño de diferente magnitud en diversos tejidos, debido a su citotoxicidad inespecífica. Entre dichas moléculas, capaces de producir inflamación neurogénica, encontramos a la ciclofosfamida (CFM); la CFM es un fármaco para el tratamiento de una serie de enfermedades malignas y autoinmunes. Sin embargo, su uso produce toxicidad inespecífica de diferente tipo, incluyendo cistitis neurogénica en los sujetos que la reciben, con una incidencia de hasta un 78% (Grimberg-Funes y col., 1990). Se sabe que dicho efecto es debido a la acción de su principal metabolito, la acroleína, sobre el urotelio (Phillips y col., 1961; Fraiser y col., 1991).

Relación entre el NO y la sustancia P: Modelo experimental de inflamación neurogénica inducida por agentes citotóxicos
Se ha demostrado que la vasodilatación inicial producida por la sP se origina por la activación de receptores NK1 en el endotelio arterial, promoviendo, entre otras cosas, la liberación de óxido nítrico (NO) (Regoli y col., 1994; Maggi, 1997). Este último efecto es en parte responsable de la extravasación plasmática temprana (Regoli y col., 1994; Maggi, 1997). El hecho de que la activación del receptor NK1 promueva la síntesis de NO y que dicha molécula sea reconocida como agente proinflamatorio, permite inferir el posible papel del bloqueo del receptor NK1 y del bloqueo de la síntesis de NO sobre la inflamación inducida por CFM en vejiga urinaria y por el CPT en tejido renal. Adicionalmente, el daño causado por el atineplásico puede inducir la síntesis de citocinas y estas podrían estimular la expresión de la iNOS. Desde mediados de los años ´90 aparecieron algunos trabajos indicando una relación entre la sP, el NO, la inflamación y el daño celular. Por ejemplo, experimentos realizados por Ralevic y colaboradores (1995) habían demostrado que el NO es el mensajero responsable de la respuesta dilatadora microvascular que se produce en el modelo de inflamación inducida por sP, en la piel de la rata. También en ratas, había sido demostrado un incremento de la producción glomerular de NO al inducir insuficiencia renal con gentamicina (Rivas-Cabañerero y col., 1994). En 1998, Szabó y Dawson, proponen un mecanismo molecular que podría explicar el papel del NO en la inflamación; ellos propusieron que el NO producido como consecuencia de señales inflamatorias se combinaría con radicales superóxido para producir peroxinitritos, capaces de producir daño de la doble hélice del DNA, con la consecuente activación de la sintasa del poli-ADP-ribosa (SPAR). El incremento en la síntesis de poliribosa produce una falla energética, que lleva a la muerte celular. Esta vía podría activarse simultáneamente con otros con mecanismos citotóxicos independientes de la generación de SPAR, generándose un mayor daño celular (Szabó y Dawson, 1998).

En humanos, Lyons (1996), demostró que la administración de interleukina-2 para el tratamiento de enfermedades malignas, puede causar un síndrome de extravasación plasmática por vasodilatación, que se acompaña de niveles elevados de nitratos tanto en sangre como en orina; los autores señalaron al NO como promotor del mencionado incremento de la permeabilidad vascular. La elevación los niveles de nitratos y nitritos en orina también fue reportada en pacientes con cistitis inducida químicamente, y que tenían cultivos urinarios negativos (Lundberg, 1996). Por otra parte, se ha demostrado que compuestos antagonistas de los receptores NK1 poseen el potencial para prevenir el daño causado por procesos inflamatorios neurogénicos, que involucren la extravasación de proteínas plasmáticas y el daño celular (Awulalia y col., 1994; Alfieri y Gardner, 1997; Alfieri y Gardner, 1998).

Con base en los antecedentes experimentales expuestos, emprendimos una serie de estudios en animales, con la finalidad de alcanzar estudiar el papel de la sP y del NO en la producción de la cistitis neurogénica por CFM, así como la posible actividad terapéutica contra la inflamación neurogénica de antagonista NK1 e inhibidores de la síntesis del NO.

Para alcanzar los objetivos experimentales, se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley. En un experimento piloto se determinó que el tiempo necesario para que la CFM (150 mg/kg, i.p.) produjera aumentos significativos en la excreción urinaria de nitratos + nitritos en dichos animales es de 6 horas. Este aumento se acompañó por un incremento en la actividad de iNOS cuantificada como cambios en la formación de 14[C] citrulina a partir de 14[C] arginina (Alfieri y col., 2000).

Posteriormente, y en la misma especie, se evaluó la actividad de drogas antagonistas NK1 (GR205171 y WIN-51708) y de los siguientes inhibidores de la NOS: la N-nitro-L-arginina (L-NNA, no selectivo); la s-metilisotiourea (MITU, selectivo endotelial) y el 7 nitroindazol (7-NI, selectivo neuronal).

Estos tratamientos, salvo el realizado con el inhibidor de la isoforma neuronal de la NOS, produjeron reducciones significativas de la producción de nitratos + nitritos y de la extravasación de proteínas plasmáticas (EPP, considerado una medición indirecta de inflamación y edema) (Fig.16A)(Fig.16B) (Tabla4), junto con una mejoría histológica (Alfieri y Cubeddu, 2000; Alfieri y Cubeddu, 2002 y Alfieri y col., 2001).

Los resultados de estos trabajos sobre el papel del NO en la cistitis neurogénica por CFM, junto con hallazgos previos (Alfieri y Gardner, 1997; Alfieri y Gardner, 1998) ponen de manifiesto el importante papel de la sP, los receptores NK1 y de la generación de NO en la citotoxicidad inducida por CFM en vejiga urinaria de la rata.

Con base en nuestros estudios y en las evidencias previamente publicadas (Cox, 1979; Ahwulalia y col., 1994; Szabó y Dawson, 1998), propusimos el siguiente mecanismo para la producción de cistitis inducida por CFM: la acroleína, metabolito urinario de la CFM, al concentrarse en la vejiga y entrar en contacto con el urotelio, estimula, entre otras, a las fibras ricas en sP y, por estimulación antidrómica, se liberaría este péptido, activando receptores NK1. También se estimularía la producción de citokinas, interleukinas y factor de necrosis tumoral. Esto sería parte de las señales inflamatorias, capaces de estimular la iNOS presente en macrófagos, células epiteliales y endoteliales, con el consecuente incremento en la producción del NO, el cual actuaría como un mediador importante del proceso inflamatorio y de la citotoxicidad producida por la CFM. Los antagonistas de los receptores NK1 bloquearían dicho receptor por lo cual la sP (u otra neurokinina) sería incapaz de activarlos; esto prevendría parcialmente el inicio del proceso, en este caso, inflamación neurogénica en la vejiga urinaria. Los resultados obtenidos con el inhibidor de la síntesis del NO (L-NNA) explican porqué la activación del receptor NK1, sin subsiguiente síntesis de NO, es capaz de iniciar otros procesos mediados por sP, como EPP; sin embargo, al estar inhibida la NOS, tanto la EPP como el daño celular son menores, debido a que no se producen los procesos de destrucción celular mediados por el NO, en la vejiga urinaria. El hecho de que el 7-NI no haya producido cambios en la excreción de nitratos + nitritos refuerza la evidencia que señalan que es la forma iNOS, y no la nNOS la isoforma que juega un papel fundamental en el desarrollo de cistitis por CFM.(Fig.16A) (Fig.16B)(Fig.17)

Adicionalmente, puede concluirse que, aunque la sP y el NO son importantes en la producción de la cistitis producida por CFM, otros mecanismos de inflamación diferentes también deben estar operando, ya que la administración conjunta de un antagonista NK1+ el inhibidor selectivo de la iNOS solo fue capaz de prevenir parcialmente el daño en vejiga urinaria (cuantificado como EPP y por evaluación histológica).