El Óxido Nítrico
Hace apenas 20 años hubiera sido difícil aceptar la hipótesis de que un gas tóxico ejerciera importantes funciones como mediador del metabolismo celular. Sin embargo, en la actualidad dicho concepto es una realidad, y el óxido nítrico (NO) se ha convertido en el protagonista de un área de creciente interés para fisiólogos, farmacólogos y neuroquímicos, entre otros, generándose sólo en el año 2002, unas 9000 publicaciones científicas. El NO es una molécula única, con las características propias de un neurotransmisor; tiene actividad vasodilatadora, estimulante de la síntesis de músculo liso vascular, antiagregante plaquetario, y está involucrado en la génesis de enfermedades como hipertensión, shock séptico, inflamación y demencia, entre otras (Vallance y Collier, 1994; Court y col., 2002).

Aunque el impacto sobre el conocimiento de la naturaleza y las propiedades del NO ha avanzado aceleradamente en las últimas década, el inicio real de la historia se remonta al siglo anterior, cuando compuestos como la nitroglicerina eran utilizados para el tratamiento de la angina de pecho. Aunque los científicos del siglo XIX sabían que la nitroglicerina era un explosivo potente, desconocían por completo lo que la convertía en un tratamiento eficaz para la angina; se aceptaba que de alguna forma, relajaba al músculo liso vascular, permitiendo que los vasos se dilataran y pudiera llegar un mayor flujo de sangre al corazón.

Pasaron más de 100 años y una apasionante serie de experimentos se inicia simultáneamente en varios laboratorios. En 1980, Furchgott y Zawadzki descubrieron que el endotelio desempeña un papel crucial en la respuesta vasodilatadora producida por acetilcolina (ACh), demostrando que la misma no actúa directamente, sino que promueve la liberación de otra sustancia, denominada por ellos como "factor relajador derivado de endotelio" o FRDE. Aunque Furchgott sabía que el FRDE existía, no pudo aislarlo ni identificarlo. El descubrimiento del FRDE hizo que las investigaciones aumentaran súbitamente, con la contribución de numerosos grupos en todo el mundo trabajando en la búsqueda de la identidad de este factor.

Los experimentos decisivos que permitieron identificar al FRDE como NO fueron llevados a cabo de forma independiente por Ignarro, en la Universidad de Los Ángeles, por Furchgott en la Universidad del Estado de Nueva York y por Salvador Moncada en los Laboratorios Wellcome Research, en Inglaterra. Los tres investigadores descubrieron que tanto el NO como el FRDE compartían características comunes que apuntaban a una única identidad. En una conferencia científica, en julio de 1986, Ignarro y Furchgott presentaron de forma independiente sus resultados ante una audiencia escéptica, publicándolos posteriormente también por separado (Ignarro y col., 1987; Furchgott y col., 1987). Pocos meses después, Moncada zanjó la discusión con un importante artículo al que se ha hecho referencia frecuentemente, pues en el mismo se demostró claramente que el NO era producido por células endoteliales y que era sin dudas el FRDE (Palmer y col., 1987). En un comentario adjunto al artículo de Moncada se describían estos hallazgos como "la culminación de una de las sagas más interesantes en la fisiología y farmacología vascular".

Esta serie de resultados fue recibida con sorpresa en el campo biomédico, ya que era difícil de aceptar que un gas tóxico tuviera funciones regulatorias tan importantes; adicionalmente, en células de mamíferos no se conocía ninguna vía bioquímica que resultara en la producción de NO. Sin embargo, las evidencias experimentales fueron aclarando la situación; para entender completamente cómo funcionaba el sistema, los científicos aún tenían que demostrar la ruta de síntesis. La respuesta llegó al poco tiempo, con experimentos realizados por Moncada y su grupo, en células endoteliales vasculares, donde se demostró que el aminoácido L-arginina es el precursor de la síntesis del NO (Moncada y col., 1989).

Síntesis del Óxido Nítrico
Como ya se dijo, y debido a su naturaleza gaseosa, el NO tiene propiedades diferentes a las de cualquier otro neurotransmisor; esta entidad química no puede ser almacenada en el interior de vesículas para ser posteriormente exocitada. En consecuencia, cuando una célula produce NO, éste escapa a través de la membrana celular difundiendo a las proximidades. Esa misma propiedad de atravesar las membranas permite al NO afectar a otras células sin necesidad de receptores en la superficie. Se trata por tanto de una molécula-señal que puede ser liberada desde cualquier parte de la neurona (donde se encuentre la enzima de síntesis) y actuar sobre la misma célula que la produce o cualquier célula en las proximidades, que pueda responder a ella.

En la Figura 2 se muestra un esquema de la síntesis de NO. En dicha reacción una molécula de L-arginina es transportada al interior de la célula endotelial por un transportador específico, generándose una molécula de L-citrulina y una molécula de NO; todo esto es catalizado por la enzima sintasa del NO (NOS) (Schmidt y col, 1988). Para la síntesis del NO, además del sustrato L-arginina, se requiere de la presencia de calmodulina y de 4 cofactores: mononucleótido de flavina (FMN), dinucleótido de flavin adenina (FAD), tetrahidrobiopterina (THB) y dinucleotido fosfato de nicotinamida adenina (NADPH). Esta reacción puede ser inhibida por derivados estructurales de la L-arginina, como la N-mono-metil-L-arginina (L-NMMA) y el metilester de N-nitro-L-arginina (L-NAME), entre otros.

El NO, a temperatura y presión atmosférica ambiente es un gas; y actúa como un soluto no-cargado en la mayoría de los procesos biológicos (Yun y col., 1996). Al tener un electrón desapareado, se comporta como un radical libre y en consecuencia es muy reactivo; debido a esto tiene una vida media de segundos, y es capaz de combinarse con rapidez a otros radicales libres. Una vez liberado y ejercer sus efectos, se descompone para producir dos metabolitos estables, los radicales nitrito y nitrato, en una reacción que puede ser catalizada por metales de transición, incluyendo al hierro.

Sintasas del Óxido Nítrico (NOS)
Debido a las características del NO, esta molécula no puede ser almacenada; debido a esto, la regulación de la enzima que cataliza su síntesis es muy importante; de hecho, la sintasa del NO (NOS) está regulada más estrechamente que cualquier otra enzima en la vía de síntesis de neurotransmisores.

Hasta el momento, han sido identificadas tres isozimas de la NOS, constituidas por subunidades homodiméricas con pesos moleculares entre 125 y 155 Kda (Knowles y Moncada, 1994). Las tres isoformas están codificadas en tres genes, localizados en tres cromosomas diferentes. La nomenclatura de las NOS se ha prestado a confusión; actualmente se utiliza la aceptada por la Unión Internacional de Farmacólogos (IUPHAR, en inglés) (Moncada y col, 1997), la cual se resume en la Tabla 1.

Las 3 isoformas reconocidas son:

1. Dos isoformas constitutivas (cNOS) ambas dependientes de calcio: la isoforma endotelial (eNOS), también conocida como tipo III (NOS3) y la isoforma neuronal (nNOS), también denominada tipo I (NOS1). Dichas isoformas median la producción de NO en cantidades bajas y fisiológicas, para actuar como señalizador molecular (Moncada y col., 1997).
2. Una forma inducible (iNOS), independiente de calcio, también denominada de tipo II (NOS2), cuya expresión puede ser inducida en diferentes tipos de células, tales como macrófagos, hepatocitos, neutrófilos, músculo liso y endotelio; dicha inducción se produce como respuesta a diferentes estímulos inmunológicos tales como: el interferón gamma (IFN-?), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-?) y el lipopolisacárido bacteriano (LPS). Esta isoforma cataliza la producción de gran cantidad de NO, que puede ser tóxico en ciertas circunstancias o para ciertos grupos celulares (Moncada y col., 1997).

Las tres isoformas de la NOS contienen un dominio carboxi-terminal homólogo al citocromo P450, con una flavina como grupo prostético, y un dominio amino terminal con un grupo heme como grupo prostético. Estos dominios terminales están conectados por un tercer dominio, que es afín a calmodulina. La unión de la calmodulina a la NOS parece ser el "interruptor molecular" que permite el flujo de electrones desde el dominio reductasa hacia el grupo heme, permitiendo la transformación del O2 y L-arginina en NO y L-citrulina (Kelly y col., 1996). Las isoformas constitutivas NOS1 (nNOS) y en la NOS3 (eNOS) se encuentran inactivas hasta que aumenta el calcio intracelular. Por ejemplo, en las células endoteliales, la ACh, la bradiquinina, el ADP o el estrés de roce son capaces de iniciar la señal que incrementa el calcio celular, el cual regula la unión de calmodulina a su dominio, iniciando la síntesis de NO. Cuando la calmodulina se une a la enzima, los electrones donados por el NAPDH fluyen desde el dominio reductasa hacia el dominio oxigenasa y son aceptados por el citocromo C y otros aceptores de electrones.

En contraste, en la isoforma inducible (NOS2, o independiente de calcio), la calmodulina permanece fuertemente unida, aún a bajas concentraciones de calcio, actuando esencialmente como una subunidad mas (Kelly y col., 1996). En este caso, los electrones donados por el NADPH son transportados por el FAD y por FMN hacia el grupo heme. En estas condiciones, la iNOS cataliza la producción de una mezcla de aniones superóxido (O2-) y de NO en altas cantidades, produciendo peroxinitritos (ONOO-), con capacidad para producir citotoxicidad. En ausencia de THB, la NOS genera H2O2, O2- y NO (Ferrer y col., 1998; Moncada y col., 1997)

Se ha demostrado que la NOS de macrófagos es inducible. Los macrófagos no estimulados no tienen la enzima, pero la activación de la célula se acompaña de la aparición irreversible de la enzima iNOS. Es decir, la producción de la iNOS es regulada transcripcionalmente (presencia o ausencia); mientras que la forma cNOS (presente, por ejemplo en endotelio vascular) es regulada en relación con su actividad (siempre está presente, pero puede estar mas o menos activa). Este programa de activación es el más importante, pero no es el único. Se sabe que las células musculares lisas también contienen pequeñas cantidades de iNOS. La activación crónica de las células endoteliales puede incrementar la síntesis de dicha isoforma e incrementar la síntesis total de NO (Gosgnach y col, 1999). Por ejemplo, este evento puede ocurrir durante el entrenamiento físico crónico, donde el flujo sanguíneo elevado es un estímulo frecuente que favorece la expresión de la cNOS endotelial.

La enzima constitutiva endotelial (eNOS) tiene un sitio de miristilación, capaz de unirse a un ácido graso. Esto le permite asociarse a la membrana lipídica de las células, a diferencia de las otras isoformas, que no tienen este brazo lipídico, y en consecuencia, son hidrosolubles y se encuentran libres en el citoplasma. Se cree que la asociación de la eNOS a la membrana facilita que el NO formado esté más cercano al exterior celular y en consecuencia difunda más rápidamente hacia la sangre y hacia el músculo liso adyacente (Gosgnach y col., 1999).

El NO sintetizado por la vía constitutiva ejerce sus diferentes efectos mediante su interacción con el centro heme de la guanilato ciclasa soluble; esta activación induce un incremento del GMPc. La isoforma inducible de la NOS esta ausente de macrófagos y hepatocitos, pero cuando estas células son activadas por citocinas, la iNOS se expresa, produciendo grandes cantidades de NO que forma entidades muy reactivas y capaces de inactivar enzimas que contienen metales de transición, como ciertas enzimas mitocondriales (Vallance y Collier, 1994). Actualmente la iNOS es considerada como parte del sistema inmune (Hibbs, 1991).

Blancos moleculares del Óxido Nítrico
Como ya fue mencionado, el NO tiene muchos "blancos moleculares" o sitios de unión. Es capaz de ligarse covalentemente al grupo heme de diversas proteínas; interactúa con radicales libres para formar peroxinitritos; interactúa con átomos de hierro o de cobre, presentes en enzimas; se une a grupos tioles libres de varias proteínas y así puede ser transportado. De todos esos sitios potenciales de unión del NO, el más importante en el sistema cardiovascular es el grupo heme de la guanilato ciclasa soluble. Dicha unión causa un desplazamiento alostérico de grupos histidina y un cambio conformacional en la enzima, activándola para producir GMPc (Michel, 1999).

Las células musculares lisas contienen una fosfodiesterasa V, específica para el GMPc. Esto activa a una protein kinasa dependiente de GMPc, llevando a la extrución de calcio desde el citoplasma, por medio de una bomba calcio/magnesio ATPasa y la consecuente relajación del músculo liso (Dusting, 1995). Los medicamentos nitrovasodilatadores actúan de modo similar, ya que son metabolizados a moléculas donadoras de NO, produciendo la serie de eventos que producen vasodilatación (Dusting, 1995).

Inhibidores de las Sintasas del Óxido Nítrico
Un punto clave para el descubrimiento de las funciones fisiológicas del NO fue el hallazgo de que análogos de L-arginina actúan como inhibidores específicos y competitivos de la NOS. El primer compuesto con estas características a ser identificado fue un derivado metilado simple de dicho aminoácido, la NG-monometil-L-arginina (L-NMMA), el cual fue inicialmente utilizado en estudios de acciones citotóxicas de macrófagos activados, mucho antes de que se descubriera que el NO participa en dicho proceso (Hibbs y col., 1990). Ha sido descubierto un gran número de análogos de la L-arginina que inhiben la actividad de la NOS, algunos con actividad irreversible o con capacidad de inhibir tanto a la isoforma inducible como a la constitutiva; en la Tabla 2 se muestran los mas representativos y comúnmente utilizados (Moncada y col, 1991; Moncada y col., 1999).

Nombre	Abreviación	Estructura	Selectividad
N -monomethyl-L-arginine	L-NMMA		nNOS = Enos > iNOS
N -nitro-L-arginine	L-NA		nNOS = eNOS >> iNOS
N -amino-L-arginine	L-NAA		nNOS = iNOS > eNOS
7-nitroindazole	7-NI		nNOS = eNOS = iNOS
N- iminoethyl-L-omithine	L-NIO		iNOS > eNOS = nNOS
Aminoguanidine			iNOS > eNOS = nNOS

Cuantificación del NO en fluidos biológicos
Al ser el NO una molécula tan elusiva y que reacciona rápidamente con otros elementos, su cuantificación directa en fluidos biológicos no ha sido sencilla; se prefiere su cuantificación indirecta, lo cual puede lograrse al medir sus metabolitos en orina o en plasma. Hoy en día se acepta que prácticamente todos los nitratos y nitritos plasmáticos y/o urinarios en el humano se derivan de la ruta L-arginina/NO (Rhodes y col., 1995); sin embargo, para que esto sea cierto, deben tomarse las siguientes precauciones:

1. restricción dietética de fuentes exógenas de nitritos, como enlatados, derivados cárnicos, embutidos, lechugas. Esto debe ser seguido por un mínimo 72 horas antes de la toma de la muestra.
2. Ausencia de infección bacteriana urinaria, ya que muchas bacterias pueden producir nitritos como productos de su metabolismo. Esto debe constatarse mediante un examen de orina
3. Ausencia de inflamación activa. Debe evitarse la cuantificación de nitratos + nitritos en sujetos con infecciones sistémicas, cuadros virales o asmáticos.

Adicionalmente y debido a que el GMPc es el mediador final de la producción del NO, se ha determinado que su cuantificación podría considerarse, bajo algunas circunstancias específicas, como otra forma de medición indirecta de la producción del NO (Gosgnach y col., 1999).