Oligonucleótidos formadores de triple hélices


La formación de una estructura compuesta de tres cadenas de ácido desoxiribonucleíco o triple hélice (triplex ADN) fue descrita por primera vez en 1957. Aunque en aquel momento se desconocían las implicaciones de este descubrimiento, este ha dado lugar a un nuevo campo de investigación de rápido crecimiento, enfocado al estudio de las aplicaciones terapéuticas del triplex ADN. Durante los últimos diez años, se ha logrado un enorme progreso en la optimización de la formación de triplex ADN, así como en la caracterización de estas moléculas. Dichos avances han contribuido al desarrollo de aplicaciones tales como la mutagénesis sitio, especifica del ADN, y la inhibición transcripcional de genes de relevancia clínica.

Las triples hélices de ADN se forman cuando un oligonucleótido se une a una región de homopurinas del ADN blanco. Los oligonucleótidos formadores de triple hélices se unen de manera específica en la ranura mayor de la doble hélice de ADN, formando enlaces de hidrógeno tipo Hoogsteen o Hoogsteen reversos, con las bases de la cadena rica en purina. De acuerdo a la composición de bases y la orientación con la que se unen al ADN blanco, los oligonucleótidos pueden dar lugar a motivos pirimidínicos o purínicos7, 8.

La formación de moléculas de triple hélice de ADN es altamente específica, pero no todas las secuencias de homopurinas se unen con la misma afinidad. Ciertas evidencias sugieren que la formación de triplex purínicos estables requiere que el oligonucleótido tenga un alto contenido de G (mas de 65%), mientras que en caso de los motivos pirimidínicos, la presencia de largas secuencias continuas de citosinas protonadas tienden a desestabilizar la formación del triplex. Tanto la longitud mínima requerida para la formación de la triple hélice (típicamente de 8 a 14 nucleótidos), como los efectos desestabilizantes de las bases no apareadas dependen en gran medida de las condiciones del experimento (temperatura, ambiente iónico favorable o desfavorable, pH, concentración de oligonucleótido). Las triples hélices son estabilizadas por cationes divalentes como el Mg2+, Ca2+ y Zn2+, así como por poliaminas de origen natural como la espermina, espermidina y putrescina, los cuales actúan reduciendo las fuerzas electrostáticas repulsivas entre los fosfatos negativamente cargados de las tres cadenas. La cinética de la formación de triple hélice es aproximadamente dos órdenes de magnitud más lenta que la formación del dúplex. Bajo condiciones en las cuales el oligonucleótido esta en un exceso de 10 veces en relación a la cantidad de ADN blanco, la saturación de un sitio de homopurina en un plásmido requiere de más de ocho horas.

El uso de triplex ADN como herramienta en medicina molecular esta sujeto a la solución de algunos problemas que limitan actualmente su utilidad 15,19. Uno de ellos tiene que ver con la dificultad de hallar en el genoma secuencias de homopurinas lo suficientemente largas para formar triplex estables y la desestabilización causada por la presencia de bases no apareadas. Otra dificultad que debe ser superada en el caso de los motivos pirimidínicos, es la necesidad de protonación de la citosina. Por otro lado, los oligonucleótidos ricos en G tienen la tendencia a formar complejos intermoleculares en el motivo purínico. Pero quizás los problemas más importantes son aquellos inherentes al diseño de la terapia con oligonucleótidos, como son el transporte del agente al interior de la célula, la tasa de incorporación celular y su estabilidad.

Aún así el potencial de uso de los oligonucleótidos formadores de triplex es tan promisorio que varios grupos de investigación y compañías de tecnología han enfocado sus esfuerzos a la solución de estos problemas, desarrollando ingeniosas estrategias para superar los obstáculos19, 23. Por ejemplo, en relación a la compensación del efecto desestabilizante de las bases no apareadas, se han diseñado análogos con una menor sensibilidad al efecto disruptivo del desapareamiento, mediante modelaje molecular. Asimismo, se han usado "linkers" sin bases (1,2-dideoxy-D-ribosa) para "saltar" las bases no apareadas. En cuanto a la necesidad de protonación de la citosina en los motivos pirimidínicos, este puede ser solucionado mediante el uso de bases no naturales, las cuales mantienen las propiedades de puentes de hidrogeno de la citosina, pero no requieren protonación, como la 5-metilcitosina o 2'-O-methylpseudoisocytidina. En el caso de los motivos purínicos, el mayor inconveniente es la inestabilidad del triplex en presencia de concentraciones fisiológicas de cationes monovalentes, especialmente K+ y Na+, lo cual podría explicarse por la formación de dímeros y tetrámeros, o por el desplazamiento de cationes multivalentes más estabilizantes como el Mg2+ y el Ca2+. Con la finalidad de evitar este fenómeno, se han desarrollado análogos nucleotídicos, como el 7-deaza-2'deoxy-guanosina o el 2'-deoxy-6-tioguanosina, que contrarrestan este problema. Otra opción es reemplazar el esqueleto negativamente cargado del oligonucleótido por una cargado positivamente, obviando la necesidad de las sustancias catiónicas. Dentro de esta categoría destacan los oligonucleótidos fosforamidatos (con enlaces N,N-Dietil-etilendiamino fosforamidatos) y los morfolino pirimidinos16, ambos han sido estudiados con éxito. Finalmente, una alternativa valida para mejorar la estabilidad de la formación de triplex, consiste en acoplar a los oligonucleótidos, agentes inespecíficos de enlace a ADN. En este sistema los oligonucleótidos aportan la especificidad al sistema, mientras que el agente inespecífico contribuye a incrementar la estabilidad. Entre los agentes de "anclaje" que están siendo probados se encuentran agentes intercalantes como la acridina y el oxazolopiridocarbazol, poliaminas como la espermidina, agentes fotoreactivos como el psoralen, y agentes que estabilizan preferencialmente las triple hélices (en lugar de las doble hélices) como la 2,6-aminoantraquinona o el BePI 27.

La mayor parte de los trabajos de investigación realizados en los últimos años en el área, tienen que ver con mejorar la estabilidad y el transporte de los oligonucleótidos formadores de triplex al interior celular 9,11. Las estrategias usadas incluyen el acoplamiento de oligonucleótidos a policationes, tales como polilisina, el uso de conjugados ADN-transferrina/polilisina en presencia de la cápside de adenovirus de replicación deficiente, conjugación con péptidos fusogénicos, el uso de receptores específicos como el del folato o transferrina, conjugación a colesterol, y la más exitosa, la conjugación a lípidos catiónicos. Recientemente, se publicó un trabajo elaborado por Lewis et al., que reporta el uso de GS2888 citofectina para mejorar el transporte de oligonucleótidos y ADN al interior de células mamíferas. El compuesto es una formulación de un agente fusogénico con un novedoso lípido catiónico que tiene una cadena alquil de longitud optimizada. Este agente permite la transfección del ADN con alta eficiencia y baja toxicidad, y que retiene su actividad en presencia de suero. Una opción prometedora es la de generar los oligonucleótidos in vivo, eliminando el problema de la inmunogenicidad, la absorción celular, la variación de la dosis y el costo. Se ha propuesto utilizar un vector que permita la expresión constitutiva de oligonucleótidos, en diferentes tipos de células.

Los oligonucleótidos formadores de triple hélices tienen el potencial de funcionar como herramienta para la manipulación de la expresión génica, a través de su capacidad de unirse a un blanco de forma secuencia-especifica. Esta propiedad ha sido usada en el diseño de varias estrategias de interferencia génica, algunas de ellas de relevancia para aplicaciones clínicas. A continuación haremos referencia a algunos de los ejemplos más interesantes en este sentido 3,14.