Tres eventos en el ciclo de vida del VIH. La partitura en ejecución

1. Enlace a la membrana de la célula huesped.

El gen env de VIH codifica para un único producto glicoprotéico, gp160, el cual es clivado para producir dos productos, gp120 y gp41²⁶. El virus enlaza a la superficie celular a través de una interacción de alta afinidad (1-10 nm) entre gp120 y el receptor celular, CD4^{40, 41}, y un co-receptor, miembro de las familias de los receptores transmembranales de quimoquinas^42,43 con afinidades 80-1000 nm³⁴. Una buene parte de la actividad neutralizante en el suero proveniente de pacientes VIH+ es dirigido contra las proteínas gp120 y gp41²⁶. gp120 es una proteína glicosilada, cuyos carbohidratos constitutivos contribuyen significativamente al enlace con la molécula CD4. Por su parte, CD4 se distribuye en diversas poblaciones celulares, tales como células T, macrófagos, células dendríticas y microglía⁴³ y parece ser el principal elemento receptor para VIH. Sin embargo, para VIH se han reportado –como se indicó- al menos dos co-receptores de quimoquinas, CXCR4 y CCR5^{42, 43},implicados en la entrada del virus. CD4 enlaza dentro de un bolsillo en la glicoproteína gp120 cuya area de contacto es de una extensión de ~ 800 angstroms³³. Una región adyacente a la sección "V3 loop", area altamente variable en la glicoproteína gp120 y que tiene un rol en la determinación del tropismo y en la inducción de anticuerpos neutralizantes^44,45, parece contactar con el receptor CCR5 localizado sobre la membrana celular ³³. Polimorfismo para la molécula CCR5 implicado en resistencia a la infección por el VIH ha sido reportado⁴⁶. Así, la variante por delección, D 32, es presente alrededor de un 5% de los individuos resistentes⁴⁷. Por su parte, la molécula CXCR4 (llamado "fusina"), primer co-receptor detectado para VIH⁴⁸, es un receptor celular para el factor 1 derivado de células del estroma (SDF-1). Diversos trabajos parecen indicar el rol de CXCR4 en infección por el VIH. Así, una linea célular magacariocítica UT-7 CD4+ resistente a la infección devienen susceptible después de transfección con el gen codante para CXCR4⁴⁹ y células neuronales CD4- son suceptibles a la infección por el VIH por utilización de este receptor celular⁵⁰.

Si bien la presencia de otros co-receptores potenciales ha sido reportada para VIH, su existencia es aún controversial. Sin embargo, proteoglicanos heparan-sulfato (HSPG), receptores manosa, receptores de adhesión de leucocitos, CD26, CD44, CD7 y galctosilceramida, han sido implicados como medios de entrada para VIH³⁴.

2. Genes regulatorios/accesorios de VIH-1

Como se destacó anteriormente, el genoma de VIH contiene los genes estructurales (gag y env) y enzimatico (pol) cuya definición y organización es típica de la familia Retroviridae. Sin embargo, ademàs de éstos genes característicos, el genoma de VIH codifica para proteinas regulatorias de la expresión viral (Tat y Rev) como también proteínas "auxiliares" (Nef, Vif, Vpu y Vpr) con funciones modulatorias de la expresión viral y de la patogénesis.

(2.1) tat.

Es el denominado gen transactivador. Dicho gen es un regulador positivo que incrementa la tasa de su propia síntesis y la síntesis de todas las otras proteínas virales⁵. La proteína Tat tiene un peso molecular de unos 16 Kda y toda su función transactivadora es localizada en la región N-terminal de unos 72 amino ácidos, codificada por el primer exón⁵¹. La función de Tat es dependiente de una secuencia específica de reconocimiento, Tar, localizada en la región 5’ de los ARN mensajeros virales (ARNm) en posición +1 y +45. Tat actua básicamente en la étapa de elongación transcripcional utilizando varios cofactores celulares para su acción⁵². Así, un complejo proteín kinasa celular llamado TAK (Tat-associated kinase) es capaz de fosforilar el extremo COOH-terminal (CTD) de la ARN polimerasa II, pues una hiperfosforilación de esta fracción estimula una eficiente elongación transcripcional. El componente kinasa del complejo TAK, Cdk9, interacciona con la proteína Ciclina T (CycT) celular, la cual incrementa la afinidad de la proteina Tat por Tar ³⁰.

(2.2) rev.

El regulador de la expresión protéica viral, la proteína Rev (~ 18 kD), consiste de un dominio NH₂-terminal que (1) media enlace con una larga estructura ARN "stem-and-loop" de 234nt y localizada en el intron env (llamada RRE –Rev-responsive element-)⁵⁴, (2) permite multimerización Rev-Rev sobre un único ARN viral portando secuencias RRE⁵⁵ y (3) posee secuencias que determinan retención nuclear⁵⁶. La región COOH-terminal con una secuencia consensus para una señal de exportación nuclear (NES)⁵⁷. Así, la proteina Rev facilita la exportación de ARNm virales, unspliced (~ 9 kb) y parcialmente spliced (~ 4 kb), del nucleo al citoplasma celular en cooperación con factores celulares, Exportina-1(XPO) y Ran guanosina trifosfato^30, .

(2.3) vpu.

Vpu, la proteína accesoria transmembranal de unos 16 kD, fue implicada en el eficiente ensamblaje y gemación de la particulas virales⁵¹. Experimentos utilizando NMR (Resonancia Magnética Nuclear) demuestran que la proteina Vpu forma discretos canales iónicos en bicapas lipídicas, cuya actividad esta asociada al dominio helicoidal transmembranal de la proteína⁵⁸. Vpu interactúa a nivel del retículo endoplásmico (RE) con la molécula CD4 activando un mecanismo de proteolisis mediado por un sistema proteosoma-ubiquitina³⁰. Sin embargo, experimentos de co-inmunoprecipitación demuestran que CD4 y Vpu también interactúan en la superficie celular⁵⁹, sugiriendo una posible inhibición de la actividad de Vpu por disrupción de su estructura oligomérica.

(2.4) Gen nef.

Similarmente a Tat y Rev, el gen nef es expresado tempranamente durante replicación viral. Nef es una secuencia altamente polimórfica. Nef parece ser un factor regulatorio negativo en la expresión genética viral; así, mutantes nef –defectivos parecen replicar más eficientemente que aquellas particulas nef+ ⁶⁰. Sin embargo, datos contradictorios han sido publicados⁶¹.

La proteína Nef es de unos 27 kD y contiene ácido mirístico al extremo NH₂-terminal⁶². Nef interactua con la molécula CD4 en la membrana plasmática promoviendo el enlace con el adaptador AP-2 y el consecuente reclutamiento en clatrina-coated pits, siendo CD4, por tanto, procesada por endocitosis⁶³. Así, un mecanismo de "down regulation" se establece alterando el tráfico de la molécula CD4, el cual parece ser un mecanismo utilizado por el virus para así establecer un óptimo de producción viral³⁰. Este eficiente mecanismo de regulación de la expresión del receptor CD4+ parece necesitar de la actividad de tres proteínas virales: Env, Nef y Vpu.

(2.4) vif.

La proteina Vif (factor de infectividad viral) (23 kDa) parece estar implicado en la eficiencia de transmisión de la infección por el VIH-1. Así, partículas vif –negativas son ineficientes en infección⁶⁴. Recientes hallazgos⁶⁸ parecen indicar que partículas defectivas en vif son ineficientes en elongación del ADN viral. La proteina Vif es fosforilada y regulada por la protein kinasa MAPK⁶⁵, kinasa activada por mitógenos. Vif posée un dominio básico, 90RKKR93,él cual parece estar implicado -también- en la regulación del tráfico nucleocitoplasmático⁶⁶. Por otro lado, la proteína ha sido implicada en el ensamblaje e infectividad de la progenie viral. Así, la poliproteína p55 (Gag) y Vif copurifican en complejos citoplasmáticos libre de membranas⁶⁷, lo que parece confirmar el aspecto de intermediario de ensamblaje de la proteína Vif.

3. La reversa transcriptasa de VIH –1

Una actividad de transcripción del tipo ADN dependiente de ARN [transcriptasa inversa o retrotranscriptasa (RT)] toma lugar en el citoplasma de la célula infectada después de la penetración y decapsidación parcial de la particula viral⁶⁸. Actividad retrotranscriptasa ha sido detectada en sistemas diferentes a los retrovirus. Así tenemos que mitocondrias proveniente de la planta Oenothera, los virus de hepatitis B, cauliflower mosaic virus y varias cepas bacterianas poseen genomas que sintetizan para enzimas con actividad retrotranscriptasa^{3, 69, 70}.

La retrotranscriptasa, VIH-1 RT, esta compuesta de dos subunidades de 66 kDa y 51 kDa denominados p66 y p51, respectivamente⁷¹. La porción N-terminal de la subunidad p66 (de unos 440 aminoácidos) constituye el dominio polimerasa, y la porción C-terminal (de unos 120 aminoacidos) comprende el dominio RNasa H. Dicho dominio C-terminal envuelve la digestión de la fracción ARN de la duplex heteropolimérica ARN:ADN generada por retrotranscripción en fragmentos oligoméricos de unos 7 – 13 nucleótidos de longitud⁷². Asimismo, la subunidad p51 corresponde al dominio polimerasa de la subunidad p66, pues la misma es generada por clivaje proteolítico. Las dos subunidades tienen en común cuatro subdominios, los cuales son denominados "fingers", "palm", thumb" y "connection" ⁷³. El subdominio "palm" contiene residuos de importancia en la actividad catalítica y su estructura plegada recuerda el plegamiento de los dominios catalíticos de otras ARN y ADN polimerasas⁷⁴. La actividad retrotranscriptasa realizada sobre el ARN viral es cebada por una molécula de ARN de transferencia, tARN^Lys y el ion preferencial es Mg²⁺ a unos 10 mM ²⁴ .

Tres estudios recientes sobre la estructura cristalina de HIV-1 RT han aportado nuevas perspectivas en los mecanismos moleculares que confieren la resistencia a ciertas drogas antiretrovirales. Así, Jacobo-Molina et al. (1993)⁷⁵ estudió por difracción de Rayos –X un complejo ternario de HIV-1 RT (Heterodímero p66/p51), un ADN patrón doble cadena de 19-bases/18-bases:primer y un fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal a una resolución de 3.0 angstroms. Kohlstaedt, L. et al. (1992)⁷³ describieron la estructura cristalográfica de HIV-1 RT acomplejada con el inhibidor "Nevirapine" a una resolución de 3.5 angstroms. Por último, Huang et al. (1998)⁷⁶ determinaron la estructura de un cristal de HIV-1 RT enlazada por crosslinking con un ADN patrón: primer y un deoxynucleotide trifosfato (dNTP) a una resolución de 3.2 angstroms.

Numerosos protocolos de tratamiento para el SIDA incluyen análogos de nucleósidos bloqueadores de la elongación de la cadena ADN viral [3’-azido-2’,3’-dideoxythymidine (AZT), 2’,3’-dideoxyinosine (ddI), y 2’-deoxy-3’-thiacytidine (3TC)] y a inhibidores de la RT no nucleosidos [derivados del tetrahydrobenzodiazepine (TIBO) y la dipyridodiazepinone, Nevirapine,Delavirdine] Tanto estudios teóricos como empíricos durante la infección de VIH demuestran la alta tasa de recambio viral y la subsecuente emergencia de resistencia viral⁷⁷. Bien es cierto que el alto grado de variación en los diferentes aislados de VIH esta en relación directa a la alta tasa de incorporaciones erradas de nucleótidos de la RT dado la ausencia de un mecanismo 3’ 5’ -exonucleasa de lectura y corrección ("Proofreading") propio de las ADN polimerasas¹⁸. La aparición de mutantes del virus resistentes a drogas puede emerger bajo la presion selectiva generada por una terapia prolongada o un cambio de la misma. Así, ciertas mutaciones puntuales en la estructura de HIV-1 RT parecen ser sufientes para inducir resistencia: Lys65Arg, Lys70Arg, Leu74 Val, Gln151Met, Met184Ile/Val y Thr215Tyr/Phe^{77, 78}.